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行業新聞

2019-02-19甘草種質主要形態性狀和化學成分的遺傳多樣性分析

甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.為豆科甘草屬植物,廣泛分布于我國西北、華北、東北等地區[1],同時,甘草為藥材甘草的基原植物之一,在醫藥、食品、化妝品等行業有廣泛應用[2]。關于甘草遺傳多樣性的研究多集中于20002012年,研究人員對全國野生甘草資源開展了全面系統的調查,對不同種源甘草進行研究,發現其在形態、甘草苷和甘草酸含量、遺傳物質等方面均存在顯著的差異,且同一種源內亦存在一定程度的變異,可見,甘草豐富的遺傳多樣性是被廣泛認可的。近些年,對于甘草化學成分的研究逐漸深入[3],更多的化學成分可以被同時檢測[4-5],且研究逐漸集中于外源物質對甘草產量和質量的影響[6]以及甘草酸和甘草苷生物合成的相關功能基因[7]等方面。但甘草品種選育的進程一直進展緩慢,其主要原因是甘草3年以上才開花的植物特性[8],以及甘草種群內變異的不可控性,再加之對同一對象研究的時間多局限于3年內,缺乏對其果序和果莢的研究,尤其是同一環境長期影響下對種質形態的描述和化學成分的表征。本實驗的種質材料大部分來自本課題組2002年全國調查時收集的樣本,保證了同一種質來源于野生形態相近的一群個體,多年來模擬農田生態環境,以盡量減少原生態環境對種質形態和化學成分含量的影響。本實驗以樣本中生長良好且有完整果序的42份種質為研究對象,通過對其12個形態性狀和5種化學成分進行遺傳多樣性研究,篩選出優良種質,以期加快甘草優良品種選育的進程。

1  材料與方法

1.1  材料

供試材料為42份國內甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 種質,其中內蒙古19份,寧夏10份,新疆8份,甘肅和陜西各2份,吉林1份,見表1

1.2  方法

1.2.1  實驗設計 42份甘草種質材料為課題組20012010年收集的無性繁殖材料(橫生莖),移栽于北京靈泉藥材研究所瀕危藥用植物資源保護基地。移栽前橫生莖的長度統一修剪為1520 cm,移栽深度為20 cm,行距30 cm;同一種質的地下莖種于同一個小區內,不同小區間設置1.5 m作為保護行,保護行種植玉米并每年進行割斷處理,以防止不同種質甘草地下莖走竄。基地土壤、水分等環境條件一致,移栽后進行統一的田間管理,以消除環境和材料本底(個體大小/粗壯)對形態性狀生長的影響。

1.2.2  性狀調查與含量測定  對甘草植株地上部分形態學性狀的測量方法參考魏勝利等[9]、于福來等[10]的測定標準,篩選株高、株幅、莖粗、復葉長、小葉數上限、小葉數下限、小葉長、小葉寬、果序長、果序寬、序柄長、實際果序長共12個形態性狀指標,每個種質隨機選取10株作為樣本進行形態學數據收集。同時,每個種質收集3份粗細均勻的根部材料作為主要化學成分檢測的實驗材料,參考金燕清等[11]的測定方法測定甘草酸甘草苷甘草素異甘草苷異甘草素的相對含量。

1.2.3  數據標準化處理與統計分析  運用SPSS 19.0軟件分析各個性狀的變異系數(coefficient of variationCV)、遺傳多樣性指數(Shannon-WienerindexH)。根據計算結果將所有材料每個性狀劃分為10個等級,每1級的相對頻率(P)用于H計算。

H?∑PilnPi

Pi表示第i種變異類型出現頻率

主成分分析和聚類分析在SAS 8.2軟件中進行,各類群的平均值用Microsoft Excel 2010軟件完成,種質間的距離為Euclidean距離,聚類分析方法采用離差平方和法(Ward’ method)。

2  結果與分析

2.1  甘草主要化學成分含量的變異情況

《中國藥典》2015年版規定,甘草酸和甘草苷為甘草藥材質量的指標性成分[2]。在甘草苷的生物合成途徑中,甘草素、異甘草素與異甘草苷為相關物質。從表2中看出,各化學成分中甘草苷含量的H最高為2.05,異甘草苷含量的H最低為1.23,其余化學成分含量的H大小依次為異甘草素>甘草素>甘草酸,5個化學成分的H的平均值達1.76。異甘草苷含量的CV最大為99.50%,變異幅度為0.0410.95 mg/g;其余性狀的CV和變異幅度依次為甘草苷的CV76.14%,變異幅度為0.0219.09 mg/g;異甘草素的CV66.83%,變異幅度為0.010.11 mg/g;甘草素的CV52.77%,變異幅度為0.514.06 mg/g;甘草酸的CV44.68%,變異幅度為8.8959.35 mg/g;平均CV67.98%4個黃酮類成分的CV均高于甘草酸的CV,黃酮苷類化合物的CV大于其苷元,異甘草苷、異甘草素為代表的查耳酮類化合物的CV83.16%)>甘草苷、甘草素為代表的二氫黃酮類化合物的CV64.46%)>甘草酸為代表的三萜類化合物的CV44.68%)。可見,不同類別的化合物在甘草種質間的變異程度存在差異。
 

2.2  主要化學成分間的相關性分析

從表3中可看出,甘草種質主要化學成分含量的相關性方面,甘草苷含量與異甘草苷含量呈中度正相關,異甘草素含量與甘草苷、甘草素含量呈低度正相關。甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素同屬于黃酮類化合物,均是莽草酸途徑和乙酸-丙二酸途徑生物合成的產物,以香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物,在查耳酮合酶(CHS)和查耳酮還原酶(CHR)基因的調控下合成異甘草素,進而與β-D-吡喃葡萄糖合成異甘草苷,同時,異甘草素在耳酮異構酶(CHI)基因的調控下合成甘草素,甘草素進一步與β-D-吡喃葡萄糖結合生成甘草苷[12]
 

可見,甘草苷、甘草素、異甘草素之間存在著明確的直接與間接關系,因此在品種選育時,不應只關注甘草苷,應該同時關注甘草苷、甘草素、異甘草素的含量。異甘草苷的苷元是異甘草素,是甘草苷生物合成中的相關物質,且與甘草苷有較強的相關性,因此在質量檢測與品種選育時,也應該對異甘草苷的含量加以關注;甘草酸屬于三萜類化合物,是甲羥戊酸途徑的產物。實驗結果顯示,甘草酸含量與其他4個黃酮類化合物在含量上不存在相關性,推測可能與兩類化合物分屬于不同的生物合成途徑有關。因此,在品種選育時將甘草酸與甘草苷做相關性分析的做法是不可取的,應該區別對待。

2.3  甘草主要形態性狀的變異情況

對測定指標進行歸類描述時,將株高、株幅、莖粗作為株型描述的測定指標,復葉長、小葉數、小葉長、小葉寬作為葉型描述的測定指標,果序長、果序寬、實際果序長、序柄長作為果型描述的測定指標。從表4中可以看出,各地上部分形態性狀中株高的H最高為2.08,小葉數上限的H最低為1.10,其余性狀的遺傳多樣性指數大小依次為:復葉長>序柄長>實際果序長>莖粗>株幅/果序長>小葉寬>小葉長>果序寬>小葉數下限。株型與果型指標的H的平均值分別為1.941.85,葉型H的平均值為1.54,可見,甘草不同種質株型和果型的遺傳多樣性相對大于葉型的遺傳多樣性。

結果表明,各樣本地上部分形態性狀的差異較大,實際果序長的CV最大為37.09%,變異幅度為1.2013.90 cm,同時,果序寬(34.56%)和序柄長(34.54%)的CV相對較大,可知,不同甘草種質在果序形狀和大小方面存在較大的變異;其余性狀的CV依次為莖粗29.75%)>株幅27.56%)>果序長(27.35%)>小葉寬(24.65%)>株高(23.00%)>小葉長(22.26%)>復葉長(21.89%)>小葉數下限(20.05%)>小葉數上限(14.34%)。果型、株型、葉型CV的平均值分別為33.39%26.77%20.24%,說明葉型的變異要小于果型和株型。從以上結果可以看出,甘草不同種質間存在豐富的變異,且變異更多集中與果型和株型方面,因此,在種質收集和品種選育過程中,應該多關注果型和株型方面的變異。

2.4  聚類分析

從圖1可知,以株高、復葉長、果序長等12形態性狀與甘草苷、甘草酸等5個化學成分為指標,采用ward法,以歐式距離為遺傳距離,在遺傳距離為6.6時,將42份種質材料分為了3個類群,其中第I類群10份,第II類群21份,第III類群11份。由表5可知,第I類群10份種質的甘草苷(4.43 mg/g)和甘草酸(17.85 mg/g)含量均未達《中國藥典》2015年版標準(甘草苷>5.00 mg/g,甘草酸>20.00 mg/g),且甘草酸、異甘草苷、異甘草素含量均為3個類群中最低,但甘草素含量最高。同時,與其他兩個類群相比,其地上部分形態性狀指標中,株型指標株高、株幅、莖粗,葉型指標小葉長、小葉寬,果型指標果序長、實際果序長、序柄長均為最大,可見此類群地上部分形態性狀主要表現為株型高大粗壯、小葉偏大、果序為長圓柱形且序柄較長,可以對其產量等農藝性狀進行考察,且可以著重開發其地上部分;第II類群的21份種質的甘草苷(9.27 mg/g)和甘草酸(24.50 mg/g)含量均達《中國藥典》2015年版標準,且與異甘草苷、異甘草素含量均為3個類群中最高,但甘草素含量為最低。其地上部分形態性狀的主要表現為,小葉數上限、下限均為最多,莖粗、復葉長、小葉長、小葉寬、果序長、果序寬、序柄長均為3個類群中最小。當以甘草苷和甘草酸含量高為甘草新品種選育目標時,此類材料具有很大的潛力,其外在主要形態特征為小葉偏小且數量多(約11枚),果序形狀偏短圓柱形或球形且序柄較短,直立莖不粗壯;第III類群的11份種質的甘草苷(4.16 mg/g)含量未達《中國藥典》2015年版標準,且為3個類群中最低,但甘草酸(20.04 mg/g)含量達《中國藥典》2015年版標準。株高、株幅、小葉數上限、實際果序長為3個類群中最小,復葉長和果序寬為最大,主要特征為植株矮小,小葉少(約9枚),果序形狀接近于球形,可以作為防風固沙的種質材料。
 

由以上結果可知,第II類群的種質在新品種選育中具有很大的潛力,且包含種質數量較多,因此對其潛力進行進一步挖掘。在遺傳距離為4.6時,將21份種質材料分為了3個小類群,其中第II-1類群7份種質,第II-2類群6份種質,第II-3類群8份種質。由表6可知,第II-1類群的甘草苷和甘草酸含量均較高,能滿足質量要求,且在第II類群的特征基礎上,表現出株型相對高大,果序形狀偏短圓柱形的特點;第II-2類群各化學成分含量均表現出很高的優勢,主要表現為株型更加高大且株幅偏小,果序形態接近于球形;第II-3類群在甘草酸含量方面表現出突出的優勢,但其甘草苷含量相對偏低,株型偏矮且小葉偏小是與II-1II-2的主要區別。II-1II-2類群均可以作為甘草新品種選育的種質材料,且II-2類群在主要化學成分含量方面更具有優勢,但仍需對其產量進行進一步考察;II-3類群在甘草酸含量方面具有突出優勢,在忽略甘草苷含量,只追求甘草酸含量時,即用于提取甘草酸時,該類種質將具有更好的潛力。



2.5  主成分分析

42份種質材料的12個形態性狀與5個化學成分進行主成分分析,提取特征值大于1的主成分,將17個性狀簡化為6個因子,累計貢獻率達72.96%,包含了17個性狀指標的絕大部分信息。因子1為綜合因子,反映植株整體的形態和化學成分的特征,因子2為葉型因子,因子3為果型因子,因子4為株型因子,因子5為主要黃酮類成分的苷元因子,因子6為主要黃酮和三萜類成分的苷類因子,分別反映植株各部位形態特征和化學成分特征。

從表7可知,第1主成分的特征值為3.46,貢獻率為20.37%。在其特征向量中,載荷較高且為正值的性狀有小葉寬(0.40)、小葉長(0.37)、序柄長(0.35)、株高(0.33)、莖粗(0.32)。小葉長、小葉寬、株高、莖粗這4個性狀的增加會增加地上部分的生物量,且與產量有很大的正相關性[13],但同時會降低甘草苷(?0.28)、異甘草素(?0.21)和甘草酸(?0.17)的含量,即會降低甘草藥材的品質。由此可見,地上部分生物量的增加會影響地下部分主要次生代謝產物的積累,因此在甘草品種選育過程中,不應過度追求地上部分的生物量。
 

2主成分的特征值為2.43,貢獻率為14.27%。在其特征向量中,載荷較高且為正值的性狀為復葉長(0.52)、小葉長(0.36)、小葉寬(0.30),這3個性狀是葉部特征的指標,復葉長和葉片大小[14]的增加會提高光合作用的效率,進而提高產量,但同時降低了甘草素(?0.35)和甘草酸(?0.21)的含量,甘草素是甘草苷生物合成的前體物質,因此甘草素的降低一定程度上會導致甘草苷含量的降低。在育種中為獲得優質的甘草新品種,應選擇葉片相對小且復葉短的作為繁育母本。

3主成分的特征值為1.98,貢獻率為11.63%。在其特征向量中,載荷較高且為正值的性狀為果序長(0.54)、實際果序長(0.54)、小葉數上限(0.31),異甘草苷(0.29),由于異甘草苷含量與甘草苷含量相關性較強,為了提高甘草苷的含量,在制定篩選優良種質的形態標準時,應適當降低其果序和實際果序的長度,以及減少小葉的數量。

4主成分的特征值為1.84,貢獻率為10.80%。在其特征向量中,載荷較高且為正值的性狀為株高(0.41)、莖粗(0.30)、異甘草素(0.29),異甘草素與甘草苷合成間接相關,因此在篩選甘草苷含量高的種質時,選取種質的株高不宜太低且莖粗也不宜太細。同時,隨著株高和莖粗的增加,果序寬度呈現下降的趨勢(?0.45),果序的形狀呈現出偏圓柱形的變化。

5主成分的特征值為1.57,貢獻率為9.26%。在其特征向量中,載荷較高且為正值的性狀為異甘草素(0.50)、甘草素(0.33),載荷較低且為負值性狀為小葉數下限(?0.39)、株幅(?0.30)、小葉數上限(?0.29),由此可推知,異甘草素和甘草素含量高的種質,其外在形態表現為小葉數和株幅的降低。

6主成分的特征值為1.13,貢獻率為6.63%。在其特征向量中,載荷較高且為正值的性狀為甘草酸(0.49)、甘草苷(0.42)、異甘草苷(0.36),載荷較低且為負值性狀為小葉數上限(?0.41)、異甘草素(?0.31)。甘草苷和異甘草苷含量的升高,勢必會導致異甘草素含量的降低,這與其生物合成途徑有關。在篩選甘草酸含量高的種質時,不應選擇小葉數量異常多的種質,不宜多于11枚。

3  討論

系統研究藥用植物種質資源的遺傳多樣性對藥用植物遺傳育種具有十分重要的意義。魏勝利等[9]通過對全國36個野生甘草種群進行調查研究,發現株高、小葉長、小葉寬等8個形態性狀,莢果和種子形態[15]及甘草酸含量[16]存在顯著的地理變異,而本實驗部分材料為此次調查保存種質,在同一環境下生長多年后進行數據收集,結果表明42份甘草種質的12個形態性狀和5個化學成分含量依舊存在不同程度的變異,說明國內甘草存在豐富的遺傳多樣性,且不同種質間的變異是穩定的,不因環境的改變而消失。同時,5個化學成分H的平均值達1.76,平均CV67.98%4個黃酮類成分的CV均高于甘草酸的CV,黃酮苷類化合物的CV大于其苷元,異甘草苷、異甘草素為代表的查耳酮類化合物的CV83.16%)>甘草苷、甘草素為代表的二氫黃酮類化合物的CV64.46%)>甘草酸為代表的三萜類化合物的CV44.68%)。5種化學成分的CV67.98%)要遠遠大于地上部分形態性狀的CV26.25),但兩者的H非常相近,分別為1.761.74。以上說明無論在化學成分還是形態性狀上,甘草種質都存在很大的改良潛力。

甘草酸與甘草苷等4個黃酮類化合物為不同生物合成途徑的產物,研究表明,在不同種質中,甘草酸含量與甘草苷及其相關物質的含量之間無相關性,而4個黃酮類化合物間存在一定的相關性。于福來等[10]對二年生栽培甘草研究表明,甘草酸和甘草苷的含量受種質與環境共同的影響;魏勝利等[13]對一年生甘草研究表明,甘草酸含量與側根數存在顯著的正相關性,而與株高、莖粗、蘆頭直徑、總生物量、地下部分總生物量(根部產量)存在顯著的負相關性。在對12個地上部分形態性狀與5種化學成分含量進行相關性研究時,并未發現其具有相關性,這與前人研究不同,推測原因可能是不同生長年限與移栽方式與前人研究條件不同所導致的。

本實驗通過對12個地上部分形態性狀和5個化學成分的聚類分析發現,3個類群中第II類群的21份種質在甘草酸和甘草苷含量方面表現較好,甘草苷(9.27 mg/g)和甘草酸(24.50 mg/g)含量均達《中國藥典》標準,且與異甘草苷、異甘草素含量均為為3個類群中最高。其地上部分形態性狀的主要表現為,直立莖不粗壯,小葉偏小且數量多(約11枚),果序形狀偏短圓柱形或球形且序柄較短;第I類群甘草酸和甘草苷含量均未達《中國藥典》標準,其地上部分形態性狀主要表現為株型高大粗壯、小葉偏大、果序為長圓柱形且序柄較長。第III類群主要特征為植株矮小,小葉少(約9枚),果序形狀接近于球形,甘草苷和甘草酸的含量分別為4.1620.04 mg/g。因此,若需要符合藥典標準的甘草藥材,應該適度降低所選種質地上部分株高和莖粗,而這與魏勝利等[13]的研究結果相似。此外,本實驗由于是橫生莖移栽,無法測定其產量,此處結合已有研究結果對其產量的潛力進行評估。魏勝利等[5]的研究表明株高、莖粗與主根長、蘆頭直徑、地下部分生物量等產量指標有顯著的正相關性,小葉長、小葉寬與主根長、蘆頭直徑有顯著正相關性,于福來等[17]同樣發現株高與產量有顯著的正相關性,結合各類群的株高、莖粗、小葉數、小葉長和小葉寬等指標,第I類群高產潛力較大,而第III類群的潛力較小。運用相同的原則對第II類群的21個種質進行評估,第II-2類群在甘草酸和甘草苷含量方面均具有較大的優勢,同時在第II類群已有的形態特征基礎上,適度提高了株高、小葉長和小葉寬,及在高品質的基礎上提高了產量,可見種質V08V10V17V34V36V38可優先作為甘草新品種選育的種質材料。

主成分分析結果表明甘草主要化學成分含量與產量相關的指標(株高、莖粗、小葉長、小葉寬等)之間存在一定的矛盾,不同性狀指標彼此間存在或少或多的聯系,或是抑制,或是促進。在甘草育種實踐中,由于甘草3年以上才開花的特性,給育種工作帶來了很多困難與不便,因此從野生或栽培群體中進行定向選育成為解決甘草育種問題的有效途徑之一。甘草作為藥用植物,有別于其他農作物,不僅追求產量,更重要的是保證其藥材的質量。因此,在甘草品種選育時,應在保證品質的前提下,盡量提高其產量。我國甘草資源分布廣,種質資源豐富,對不同種質的遺傳多樣性進行合理分析將加快品種選育的進程,同時對我國甘草資源的合理開發和利用具有重要的意義。 

 

 

參考文獻(略)

 來  源:李文斌,魏勝利,羅  琳,閆濱濱,侯俊玲,于福來,崔  潔,王文全. 甘草種質主要形態性狀和化學成分的遺傳多樣性分析 [J]. 中草藥, 2019, 50(2):517-526.

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